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Feb 28, 2024

Progettazione razionale della fermentazione alcolica mirata al carbonio extracellulare

npj Science of Food volume 7, Numero articolo: 37 (2023) Cita questo articolo 221 Accessi 3 Dettagli metriche altmetriche La selezione di ceppi di lievito per la fermentazione alcolica industriale richiede laboriosi

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L'allevamento di ceppi di lievito per la fermentazione alcolica industriale richiede uno screening laborioso a causa della mancanza di strategie di modificazione in vivo. Qui mostriamo che l'ispessimento della parete cellulare specifico della quiescenza attraverso la sintesi di un componente importante, l'1,3-β-glucano, antagonizza criticamente la capacità di fermentazione cellulare sequestrando le fonti di carbonio citoplasmatico disponibili. Questo studio fornisce approfondimenti sul controllo glicolitico e riporta un progetto di fermentazione razionale efficace e affidabile.

L'attuale comprensione della glicolisi deriva dallo studio della fermentazione alcolica del lievito1. Il controllo glicolitico è una questione centrale nel metabolismo cellulare2. Il comportamento glicolitico del lievito fortemente ottimizzato, noto come effetto Crabtree3, ostacola lo sviluppo di tecnologie di allevamento per alterare la capacità di fermentazione alcolica. La proteina fosfatasi 2A (PP2A) complessata con la subunità regolatrice di tipo B55δ (Cdc55p) è l'unica responsabile dell'eccezionale attività glicolitica dei ceppi di lievito per sake Saccharomyces cerevisiae4. Livelli elevati di glucosio attivano PP2AB55δ sia nei lieviti che nei mammiferi. Negli esseri umani, il metabolismo epatico del glucosio innesca la defosforilazione dipendente da PP2AB55δ della fosfofruttochinasi-2/fruttosio-2,6-bisfosfatasi, promuovendo la produzione dell'attivatore glicolitico chiave, il fruttosio-2,6-bifosfato5,6. In S. cerevisiae, tuttavia, il suo ruolo nel controllo glicolitico rimane discutibile7. Pertanto, il meccanismo alla base della fermentazione alcolica del lievito mediata da PP2AB55δ rimane sconosciuto.

L'RNA-seq delle cellule cdc55Δ di S. cerevisiae, specificamente difettose nella funzione PP2AB55δ, all'ingresso nella quiescenza cellulare nella fase iniziale di fermentazione ha rivelato una sovraregolazione dei geni sensibili allo stress sotto il controllo di fattori di trascrizione ridondanti, come Msn2p, Msn4p (Msn2/ 4p) e Gis1p, funzionalmente associati al FoxO8 dei mammiferi (Figura 1 supplementare, Tabelle supplementari 1 e 2). La perdita di Cdc55p ha portato ad un aumento significativo dell'espressione di questi geni in modo dipendente da Msn2 / 4p (Fig. 1a, b, Figura 2 supplementare). Ciò era inaspettato perché la perdita di Cdc55p riduce l'espressione acuta di risposta allo stress di geni identici nelle cellule a proliferazione esponenziale (Figura 3 supplementare) 9. Pertanto, PP2AB55δ mostra effetti opposti nell'attivazione di Msn2 / 4p nelle fasi di quiescenza e proliferazione (Figura 4 supplementare). La delezione dei geni MSN2/4 sullo sfondo cdc55Δ ha recuperato quasi completamente il fenotipo di scarsa fermentazione (Fig. 1c e Fig. 5 supplementare), suggerendo che Msn2/4p è un importante inibitore glicolitico.

a La perdita di PP2AB55δ (cdc55Δ) migliora l'espressione dei geni mirati a Msn2/4p nella fase iniziale della fermentazione. L'asse y rappresentava i livelli di espressione relativi rispetto ai campioni di 6 ore wild-type. I valori sono le medie e le deviazioni standard di tre esperimenti indipendenti. b cdc55Δ migliora la localizzazione nucleare di Msn2p-GFP nella fase iniziale della fermentazione. Barre, 5 μm. c La bassa capacità di fermentazione delle cellule cdc55Δ dipende principalmente da Msn2/4p. WT, tipo selvaggio. (d, e) cdc55Δ migliora la sintesi di 1,3-β-glucano dipendente da Msn2 / 4p. d Livelli cellulari di 1,3-β-glucano a 24 ore dopo l'inoculazione. I valori sono le medie e le deviazioni standard di tre esperimenti indipendenti. e Osservazione TEM delle cellule di lievito a 24 ore dopo l'inoculazione. Uomo, mannoproteine; βGlc, strato di β-glucano; PM, membrana plasmatica; Cit, citoplasma. Barre, 100 nm. f Modello ipotetico di sequestro del carbonio extracellulare tramite PP2AB55δ e Msn2/4p. Glc glucosio, Glc-6-P glucosio-6-fosfato, Glc-1-P glucosio-1-fosfato, UDPG UDP-glucosio, trasportatore dell'esoso HXT, GS 1,3-β-glucano sintasi. Gli asterischi indicano valori statisticamente diversi dal WT, come determinato utilizzando il test t di Student, p < 0,05.

Msn2/4p sovraregola i geni della via di sintesi del glucosio UDP, che si dirama direttamente dalla glicolisi tramite glucosio-6-fosfato10. Il glucosio UDP è utilizzato principalmente come substrato per la biosintesi di trealosio, glicogeno e 1,3-β-glucano in S. cerevisiae. Gli shunt citoplasmatici del trealosio e del glicogeno vengono attivati ​​transitoriamente in caso di stress acuto o di ingresso in quiescenza; pertanto, la delezione dei geni per la sintesi del trealosio e del glicogeno non contribuisce positivamente alla fermentazione alcolica11. Al contrario, l’1,3-β-glucano si accumula durante il periodo di fermentazione e la sua degradazione extracellulare non rifornisce immediatamente la glicolisi. Pertanto, la sintesi di 1,3-β-glucano nelle cellule quiescenti può essere coinvolta nel controllo metabolico attraverso lo scarico di fonti di carbonio fermentabili nello spazio extracellulare. La quantificazione della parete cellulare (Fig. 1d) e la microscopia elettronica a trasmissione (Fig. 1e) hanno rivelato un marcato ispessimento dell'1,3-β-glucano nelle cellule cdc55Δ in fermentazione e la sua completa assenza nelle cellule cdc55Δ msn2 / 4Δ, inversamente correlato alle velocità di fermentazione. Pertanto, la sintesi iperattivata di 1,3-β-glucano è responsabile dello scarso fenotipo di fermentazione delle cellule cdc55Δ.